DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS

DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS: MÉTODOS DE RASTREAMENTO Uma ampla variação de técnicas são utilizadas para a identificação de doenças genéticas. Todos os métodos têm vantagens e desvantagens e requerem considerável habilidade e experiência para serem realizados. Não existe uma padronização ou preferência geral por um método, mas os laboratórios devem ser conhecedores das limitações e sensibilidade dos métodos por eles usados. A apresentação a seguir é uma síntese das diferentes estratégias, baseadas na análise do DNA, utilizadas para o diagnóstico de doenças genéticas. Doenças Genéticas: Padrões de Herança Simples ou Complexo Autossômicas Recessivas - os genes estão presentes nos autossomas e os indivíduos afetados tem duas cópias do gene mutante. Ex: Fibrose Cística. Autossômicas Dominantes - os genes também estão nos autossomas, mas basta uma cópia do gene mutante para causar a doença. Ex: Doença de Huntington. Ligadas ao Cromossomo X - os genes agem como mutações dominantes no sexo masculino. Ex: Distrofia muscular de Duchenne. Poligênicas ou Multifatoriais- resultam de mutações em genes diferentes ou surgem da interação de fatores ambientais com múltiplos genes. Ex: Doenças cardíacas coronárias, câncer e esquizofrenia. Aconselhamento Genético O aconselhamento genético é o conjunto de informações dado à família com relação ao risco de recorrência , prognóstico e possíveis tratamentos de uma determinada doença genética. Testes Genéticos Citogenético DNA Metabólico Métodos de Análise do DNA (Diagnóstico Molecular) As técnicas mais comuns de diagnóstico molecular são: amplificação enzimática do DNA (PCR) digestão da fita de DNA genômico ou produto de PCR com enzimas de restrição separação eletroforética do DNA ou do produto de PCR hibridação do DNA ou fragmentos de PCR com sondas oligonucleotídicas. Aplicações da PCR 1. A PCR permite a rápida amplificação de um gene específico ou de um exon de um determinado gene como a primeira etapa para rastreamento de mutações não caracterizadas: PCR para amplificações de exons específicos do DNA genômico RT-PCR para análise de transcritos 2. A PCR permite a rápida genotipagem de marcadores polimórficos: Como uma alternativa de RFLP pelo desenho de primers flanqueadores de sítio de restrição polimórfico, permitindo a amplificação da região do polimorfismo e digestão do produto da PCR com a enzima de restrição sítio específica. Pelo desenho de primers de seqüências que flanqueiam repetições em tandem ou seja Short tandem repeat polymorphisms (STRs), conhecidas como microssatélites, que são seqüências curtas de 1-4 nucleotídeos de comprimento, que se repetem diversas vezes em tandem e que geralmente são caracterizadas por muitos alelos. 3. A PCR pode ser usada para ensaio de mutações conhecidas A discriminação alélica pelo tamanho: pequenas deleções ou insersões em alelos que podem ser detectadas por PCR, por exemplo, deleções no alelo mais comum que causa a fibrose cística (DF508) A suscetiblidade a enzima de restrição: mutações que mudam um sítio de restrição podem ser detectadas como descrito anteriormente, pela digestão do produto de PCR com a enzima de restrição específica 4. PCR alelo-específico (teste de ARMS) Mutações conhecidas podem ser identificadas pelo desenho de três primers, um específico para o alelo mutante, o outro específico para o alelo selvagem e o terceiro é específico da região flanqueadora (conservada) do exon e que será o primer que vai encaminhar a amplificação da fita no sentido direto. O desenho é feito de maneira que o primer específico para o alelo mutante termina com a base mutada na extremidade 3’ e o primer específico para o alelo selvagem termina com a base normal em sua extremidade 3’, funcionando como uma sonda alelo específica. Este método é usado para detectar mutações específicas e foi chamado de sistema de amplificação de mutação refretária. 5. A PCR pode ser usada para rastreamento de mutações e polimorfismos de DNA A detecção de variação de seqüências no DNA é importante para a identificação de mutações que causam doenças em um determinado gene, bem como para a detecção de polimorfismos de DNA. Uma vez que uma grande fração das variações genéticas são devido às diferenças produzidas pela mudança de base única na seqüência de DNA, o uso de técnicas capazes de detectar substituições de uma única base quando se procura mutações e seqüências polimórficas foi um avanço tecnológico para a pesquisa destas variações. Alguns destas técnicas de rastreamento são: DGGE, SSCP, DHPLC. Cromatografia Líquida Desnaturante de Alta Performance (DHPLC) DHPLC é uma cromatografia líquida baseada no método de pareamento de íons em fase reversa sob condições desnaturantes. Seu princípio é: formação de heteroduplexes através da hibridação após o aquecimento e esfriamento dos produtos de PCR. separação dos heteroduplexes e homoduplexes sob condições parciais de desnaturação Método Citogenético A observação microscópica de cromossomos normais e anormais permitiram a construção de mapas citogenéticos do genoma de muitas espécies. Estes mapas mostram a localização relativa de características morfológicas dos cromossomos (ex; centrômeros, marcadores citogenéticos ou bandas) e lesões cromossômicas visíveis. O conceito de mapa citogenético tem sido estendido para incluir a ordem de seqüências de DNA derivadas de arranjos físicos dos seus sítios de hibridação. O novo método de FISH ( hibridação in situ fluorescente) é o meio mais direto de localizar marcadores moleculares e genéticos no mapa citogenético permitindo a integração entre mapas genéticos e moleculares. Sondas cosmídeos - sondas de seqüência única, que se ligam em pequenos segmentos de determinados cromossomos, úteis para o estudo de microdeleções. Painting probes - sondas específicas de regiões muito separadas ao longo de um único cromossomo, dando a ilusão de "pintar" o cromossomo inteiro, usadas para a identificação de material extra (ex: translocação)                          Sondas DNA Alfa-Satélite - composto de elementos com seqüências altamente repetitivas encontrados próximos dos centrômeros (ex: duplo sinal significa a presença de dois centrômeros). Giselda MK Cabello, MSc. Responsável pelo Projeto Fibrose Cística Laboratório de Genética Humana Departamento de Genética/IOC/FIOCRUZ